ЭКСПРЕССИЯ ε-ГЕНА ЭМБРИОНАЛЬНОГО ГЕМОГЛОБИНА ПРИ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИИ
Гемоглобины человека изучаются уже на протяжении почти века, но, тем не менее, эмбриональный гемоглобин (HbP, синоним - HbE) является одним из самых малоизученных белков человеческого организма. Сведения о HbP в научной литературе до сих пор крайне скудны. Такой парадоксально низкий интерес ученых к этому белку можно объяснить следующими причинами: а) методологический фактор: получение препарата HbP крайне затруднительно из-за сложностей получения биоматериала (HbP синтезируется только в раннем эмбриогенезе, с 5 по 18 гестации), экстрагирования и очистки белка; б) пpaктический фактор: по мнению большинства клиницистов, данный белок не представляет прикладной (диагностическо-прогностической) ценности, т.к. активность его гена полностью репрессирована как у детей, так и у взрослых [1, 2, 3, 6].
В данной работе авторы исходили из предположения, что активация ε-гена HbP в постнатальном периоде жизни человека возможна при патологии, связанной с понижением степени дифференцировки, т.н. «омоложением» клеток эритроцитарного ростка [4]. К таким состояниям можно отнести некоторые oнкoлoгические заболевания тканей красного костного мозга, в первую очередь, эритремии, сублейкемические миелозы, а также, возможно, некоторые миелолейкозы.
Цель исследования - иммунохимический качественный анализ наличия эмбрионального гемоглобина в эритроцитах больных эритромами, сублейкемическими миелозами и лейкозами различных типов.
В процессе научно-экспериментального исследования физико-химических свойств эмбрионального гемоглобина авторами разработан оптимальный алгоритм выделения этого белка [4].
Исходным биоматериалом для выделения и очистки HbP служил aбopтивный материал сроком 7-9 недель (отделение неонатологии больницы №5 г. Астpaxaни). После промывки и сортировки эмбриональные ткани подвергались механически-термической гомогенизации. После экстрагирования цитозольных белков проводили, взвесь центрифугировали при 8000 g в течение 30 мин, после чего осадок отбрасывали. Поскольку устойчивость эмбрионального гемоглобина несколько ниже, чем у фетального [6], для очистки HbP нами была модифицирована стандартная методика щелочной денатурации для выделения фетального гемоглобина [3, 6], состоящая в 40-секундной обработке смеси 1,2 М раствором NaOH, с последовательным осаждением белков раствором сульфата аммония (до 50%-й насыщенности). После центрифугирования при 8000 об/мин в течение 30 мин осадок отделяли. В надосадочной жидкости оставался эмбриональный гемоглобин с незначительным количеством белковых примесей. Полученный белковый препарат подвергали обессоливанию путем гель-проникающей хроматографии на колонке с сефадексом G-25, рабочий буфер - 0,05 М фосфатный буферный раствор рН 7,4. Окончательную очистку HbP от оставшихся щелочеустойчивых компонентов в полученном на предыдущем этапе препарате проводили путем ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефадексе G-50 на 0,01 М трис-хлоридном буфере рН 8,1 в градиенте ионной силы.
Анализ чистоты полученных препаратов осуществляли методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле.
Полученные очищенные препараты HbP использовали, в частности, для получения специфических антисывороток на данный белок методом иммунизации кроликов. Иммунизация проводилась с полным адьювантом Фрейнда по стандартной методике [5]. Для контроля качества антисывороток проводили их иммунохимическое сопоставление с другими антигенными композитами, а также специфическую окраску полученных преципитатов бензидиновым методом [6]. При наличии дополнительных линий преципитации проводили дробное истощение антисыворотки соответствующей белковой фpaкцией. В результате проведенной работы разработаны специфические иммунохимические тест-системы на эмбриональный гемоглобин, в которой тест-антигеном является очищенный препарат HbР (полученный вышеописанным способом) в рабочем разведении: 1/2 или экстpaкт тканей эмбриона (срок - 6-9 недель) в рабочем разведении 1/8-1/16. Тест-системы на использовали для иммунохимической индикации HbP в исследуемом материале.
Объектом нашего исследования являлась гепаринизированная кровь больных некоторыми гематологическими онкозаболеваниями. Всего было обследовано 107 образцов крови. Из них: 12 больных эритромами, 11 больных сублейкемическими миелозами, 31 больных острыми и хроническими миелолейкозами, 17 больных острыми и хроническими лимфолейкозами, а также 36 образцов крови здоровых людей (группа контроля) (табл.1).
Сбор биоматериала проводили в гематологическом отделении 1-й областной больницы г. Астpaxaнь.
Подготовка проб к анализу состояла в их предварительном гемолизе путем двухкратного замораживания (при -180С) и оттаивания.
Таблица 1 Перечень использованного в работе материала
Исследуемый материал (кровь) |
Количество проб |
Здоровые |
36 |
Больные эритремиями |
12 |
Больные сублейкемическими миелозами |
11 |
Больные хроническими миелолейкозами |
22 |
Больные острыми миелолейкозами |
9 |
Больные острыми и хроническими лимфолейкозами |
17 |
ВСЕГО |
107 |
Индикация HbP в образцах осуществлялась путем иммунодиффузии по Оучтерлони [5]. В ходе работы использовались моновалентные иммунохимические тест-системы на HbP (см. выше).
После иммунопроявления агаровые стекла высушивали и подвергали специфическому окрашиванию на гемоглобины гваяколовым методом, модифицированным авторами: 0,2 г гваякола в 50 мл ледяной уксусной кислоты, затем добавляли этот раствор в 0,1М ацетатный буфер рН 4,6 с 0,2% хлоридом марганца (II) до 0,3% концентрации. Туда же добавляли перекись водорода до концентрации 1%. Экспозиция 45 мин. В результате окраски гемоглобиновые преципитаты приобретали гoлyбой цвет.
Стекла фотографировали в отраженно-рассеянном свете. Считывание результатов проводили только по отчетливым окрашенным линиям преципитации.
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием статистических компьютерных программ.
В результате проведенного иммунохимического анализа исследуемого материала на эмбриональный гемоглобин методом радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони получены следующие результаты (табл. 2).
Как видно из приведенных данных, эмбриональный гемоглобин впервые выявлен в крови больных эритремиями, хроническими эритромиелозами, сублейкемическими миелозами и острыми миелолейкозами. Эти данные свидетельствуют о возможности дерепрессии гена ε-протомера (гена эмбрионального гемоглобина) при снижении дифференцировки клеток эритроцитарного ростка, сопровождающей oнкoлoгические заболевания данной ткани. Нулевая выявляемость HbP в крови гематологических больных с онкопатологией неэритроидного генеза (острые и хронические лимфолейкозы) согласуется с приведенной версией.
Таблица 2 Результаты иммунохимической индикации HbP в крови онко-гематологических больных
Исследуемый материал |
Количество проб |
Количество положительных результатов на HbP |
Процент положительных результатов на HbP |
Здоровые |
36 |
0 |
0,0 |
Больные эритремиями |
12 |
8 |
66,67 |
Больные сублейкеми-ческими миелозами |
11 |
4 |
36,36 |
Больные хроническими миелолейкозами |
22 |
1 |
4,55 |
Больные острыми миелолейкозами |
9 |
2 |
22,22 |
Больные острыми и хроническими лимфолейкозами |
17 |
0 |
0,0 |
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что иммунохимическая индикация эмбрионального гемоглобина в крови гематологических больных способствует повышению качества дифференциальной диагностики ряда онко-гематологических заболеваний.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
- Гипоксия. Адаптация, патогенез, клиника. - СПб, ООО "ЭЛБИ-СПб", 2000. - 384 с.
- Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П. Основы патохимии - СПб. «Элби-СПб». - 2000. - 182 с.
- Карпищенко А.И. - Медицинские лабораторные технологии и диагностика / А.И. Карпищенко. - Справочник, т 1, С. Петербург, 1998. - 144 с.
- Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Никулина Д.М., Краморенко П.В., Семенова Т.Б. - Иммунохимический анализ продукции эмбрионального гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека / Материалы научно-пpaктической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астpaxaнь-Волгоград-Москва. - 2006. - С.58-62.
- Никулина Д.М. - Пpaктическое освоение иммунохимических методов / Метод. рекомендации. - Астpaxaнь, - 1996. - 36 с.
- Стародуб Н.Ф., Назаренко В.И. - Гетерогенная система гемоглобина: структура, свойства, синтез, биологическая роль / АН УССР, Институт молекулярной биологии и генетики. Киев: Наукова думка, 1987. - 198 с.
Важнейшим фактором поддержания селенового статуса организма является феномен эндогенного регулирования, который проявляется как в здоровом организме, так и при различных заболеваниях. Клинические исследования гинекологических больных с гнойно-воспалительными заболеваниями позволили установить, что снижение иммунной защиты организма часто сопровождается снижением уровня селена в сыворотке крови. Обследовано 46 больных (18-37 лет). Бактериологическое типирование подтвердило присутствие: Chlamidia trachomonatis; Ureaplasma urealiticum; St. epidermidis; грам (-) флоры; грам (+) флоры; смешанной флоры; E. Colli; дрожжевых клеток; трихомонад. Интервал концентрации селена в сыворотке крови составил 32,0-89,5мкг/л. Средний показатель 64,8 ± 6,3 мкг/л (при норме 115-120 мкг/л). Показатель уровня селена в сыворотке крови доноров г.Пензы составил 81,0 ± 11,7 мкг/л. Была проведена оценка влияния селенодефицита на течение и прогноз эндотоксикоза. Таким образом, авторегулирование антиоксидантного гомеостаза в организме можно рассматривать как функцию иммунитета, а воздействие фармакологических препаратов как один из методов регулирования селенового статуса населения. ...
28 04 2024 9:29:39
Статья в формате PDF 118 KB...
27 04 2024 7:46:58
Статья в формате PDF 111 KB...
26 04 2024 18:56:26
Рассмотрены проекты, связанные с инновациями. Определены понятия: «проект, содержащий инновацию», «проекты, связанные с инновациями», «проект, вовлекающий инновации». Дана концептуальная схема взаимосвязи проектов, связанных с инновациями. Приведены примеры различных проектов. Показаны различные виды технологических и информационных потоков в комплексе проектов, связанных с инновациями Введено понятие, «среды развития инновации». Рассмотрен пример трaнcпортной инфраструктуры как среды развития инноваций. Определены условия, при которых может возникнуть открытый инновационный проект. Дается схема мониторинга результата инновации. Показано различие между полем отношений и полем взаимодействия среды с результатом инновации. Показано, что комплекс проектов является взаимосвязанным. Поэтому при реализации системы управления инновациями этот комплекс должен быть принят за основу такой системы ...
24 04 2024 13:34:12
Статья в формате PDF 280 KB...
22 04 2024 12:18:13
Статья в формате PDF 102 KB...
21 04 2024 21:35:52
20 04 2024 11:16:15
Статья в формате PDF 100 KB...
19 04 2024 2:23:43
Статья в формате PDF 351 KB...
18 04 2024 22:47:17
Статья в формате PDF 143 KB...
17 04 2024 9:14:12
Статья в формате PDF 111 KB...
16 04 2024 5:33:50
Статья в формате PDF 100 KB...
15 04 2024 1:41:28
Статья в формате PDF 275 KB...
14 04 2024 3:28:52
Статья в формате PDF 124 KB...
13 04 2024 11:11:10
Статья в формате PDF 101 KB...
12 04 2024 15:24:11
Изложены результаты технолого-экологической оценки выемки междупластья по бестрaнcпортной технологии на Кангаласском угольном разрезе. ...
11 04 2024 21:17:17
Статья в формате PDF 338 KB...
10 04 2024 16:29:25
Статья в формате PDF 105 KB...
09 04 2024 8:54:36
Статья в формате PDF 106 KB...
07 04 2024 3:41:55
Статья в формате PDF 250 KB...
06 04 2024 16:47:27
Статья в формате PDF 250 KB...
04 04 2024 14:46:26
Статья в формате PDF 269 KB...
03 04 2024 11:35:18
Проведен анализ общепринятых учений и научных теорий, имевших широкую аудиторию в вузах и научно-исследовательских институтах прошлого века. Выявлена недостаточность абстpaктной потенции в мыслительной жизни homo sensus, главная альтернатива которой – эмоциональный мир, чувственность и вера. Свойство верить познающего субъекта не носит хаpaктер религиозности, однако имеет общие с ней основания. Роднит религию и научную веру стремление не понять, а принять смутные представления, сулящие сиюминутную пользу и выгоду, объединяет желание увидеть в таинственном и запредельном нечто к себе доброжелательное, освобождающее от мучительного предназначения думать и, следовательно, уводящее от необходимости работать – работать без самообмана, но эффективно и достойно homo sapiens. ...
01 04 2024 23:15:24
Статья в формате PDF 253 KB...
31 03 2024 2:38:11
Статья в формате PDF 144 KB...
30 03 2024 8:49:34
Статья в формате PDF 127 KB...
29 03 2024 16:23:48
Статья в формате PDF 255 KB...
28 03 2024 2:54:33
Статья в формате PDF 119 KB...
27 03 2024 20:41:57
Статья в формате PDF 245 KB...
26 03 2024 5:25:43
Статья в формате PDF 131 KB...
24 03 2024 18:14:48
Статья в формате PDF 253 KB...
23 03 2024 12:55:31
Статья в формате PDF 154 KB...
21 03 2024 12:54:33
Статья в формате PDF 143 KB...
20 03 2024 3:43:16
Еще:
Поддержать себя -1 :: Поддержать себя -2 :: Поддержать себя -3 :: Поддержать себя -4 :: Поддержать себя -5 :: Поддержать себя -6 :: Поддержать себя -7 :: Поддержать себя -8 :: Поддержать себя -9 :: Поддержать себя -10 :: Поддержать себя -11 :: Поддержать себя -12 :: Поддержать себя -13 :: Поддержать себя -14 :: Поддержать себя -15 :: Поддержать себя -16 :: Поддержать себя -17 :: Поддержать себя -18 :: Поддержать себя -19 :: Поддержать себя -20 :: Поддержать себя -21 :: Поддержать себя -22 :: Поддержать себя -23 :: Поддержать себя -24 :: Поддержать себя -25 :: Поддержать себя -26 :: Поддержать себя -27 :: Поддержать себя -28 :: Поддержать себя -29 :: Поддержать себя -30 :: Поддержать себя -31 :: Поддержать себя -32 :: Поддержать себя -33 :: Поддержать себя -34 :: Поддержать себя -35 :: Поддержать себя -36 :: Поддержать себя -37 :: Поддержать себя -38 ::